GH-1基因剪切作为II型生长激素缺乏治疗的新策略

GH-1基因剪切作为II型生长激素缺乏治疗的新策略 / Targeting GH-1Splicing as a Novel Pharmacological Strategy for Growth Hormone DeficiencyType II

作者：Miletta MC. et al.

来源：Biochem Pharmacol. 2016 Jul 22. [Epub ahead of print]（IF：5.091）

〖摘要〗

单纯性GHD（Isolated Growth Hormone Deficiency，IGHD）是一种罕见病，大部分为散发，约有3%到30%是家族性的，这提示部分患儿发病原因为基因异常。家族性IGHD通常根据遗传模式分为4种类型，包括常染色体隐性遗传（IA型和IB型）、常染色体显性遗传（II型）和伴性遗传（III型）。与IGHD的遗传病因相关的常见基因包括编码GH的基因（GH-1）和编码GH释放激素受体的基因（GHRHR），约有11%的IGHD患者存在已知的基因突变。其中II型IGHD的主要病因是影响GH-1基因剪接位点的突变，这些突变导致基因在剪切过程中跳过了3号外显子，从而形成较短的17.5 kDa的GH异构体，其作用主要为阻止全长度22 kDa的GH分泌。目前，针对II型IGHD的治疗手段仍然是给予基因重组人生长激素（rhGH）治疗，然而这一治疗手段并不能复制正常的、周期性的GH分泌模式，也不能完全的防止17.5 kDa GH异构体对腺垂体的毒性作用。而17.5 kDa GH异构体对腺垂体的毒性作用可能最终会导致其他垂体源性激素的缺乏或造成垂体前叶的发育不良。本文的目的旨在对现有的针对II型IGHD治疗的手段进行综述，并评估将来这些手段能用于临床治疗的可能性。现将主要内容总结如下：

1. GH-1 基因簇：编码GH的基因（GH-1）位于17号染色体的长臂（17q22-24），包括5个外显子和4个内含子。若GH-1基因被正确的剪切，则会产生22 kDa的GH，含有5个外显子，表现出GH的正常生物活性。然而即使在正常情况下，也有少量的GH是由于基因被错误的剪切导致的，包括20 kDa、17.5 Kda、11.3 kDa和7.4 kDa的GH异构体。

2. II 型IGHD：II型IGHD是由于GH-1基因的剪接过程中的不同异常所致的。（ 注：基因表达过程首先是以 DNA 为模板合成前 mRNA ，前 mRNA 包含有外显子序列和内含子序列。通过对前 mRNA 的剪接，将内含子去除，把外显子连接起来，才能产生成熟的有功能的 mRNA 分子，从而翻译出有功能的蛋白质或者多肽。 ）通常前mRNA的剪接位点是较弱的，不易于被剪接体识别，因此需要剪接增强子来帮助其被正确识别，位于外显子序列处的称为外显子剪接增强子（ESEs），位于内含子处的称为内含子剪接增强子（ISEs）。目前已发现3种GH-1基因的剪接增强子，包括ESE1、ESE2和ISE。研究发现，ESE1的任何碱基突变都会导致外显子3在剪接过程中被完全或部分的跳过，导致17.5kDA和20 kDa的GH的水平发生变化（分别波动在35%-68%和20%-37%）之间。除剪接位点的突变之外，也有研究报道GH错义突变（P89L，R183H，V110F，R178H，L76P）也与II型IGHD相关。

3. II 型IGHD 的患者表型和临床表现：II型IGHD患者表现为血GH水平低但可以检测出来，身高受损不同，头颅MRI显示垂体前叶发育不良。通常剪接位点的突变，会导致仅产生17.5 kDa的GH异构体，因此患者会更早发病，且临床表现更严重。而ESE的突变则对患者的身高影响较小，其临床表现的严重程度与17.5 kDa与22 kDaGH的比例相关。

4.  通过RNA 干扰治疗II 型IGHD：小干扰RNA（short interfering RNA, siRNA）通常是19-22个碱基对的寡核苷酸。2004年，有研究提出可以设计针对17.5 kDa GH异构体mRNA的siRNA。研究显示，在细胞中，质粒表达的siRNA可以有效和特异性的使得跳过外显子3的GH转录减少90%。而后续的研究又进一步显示，通过将表达针对17.5 kDa GH异构体mRNA的短发夹RNA（shRNA）的转基因小鼠与II型IGHD小鼠进行交配，其子代小鼠的垂体功能得以完全恢复。以上研究提示未来可以采用siRNA或shRNA作为治疗II型IGHD的手段。但目前该方法还存在某些限制：siRNA和shRNA在细胞和动物体内都可能产生细胞毒性，而目前还欠缺能成功将外源性siRNA转运至机体细胞内的系统。临床应用siRNA需要一个有效和安全的转运系统，因为尽管垂体并不受到血脑屏障的保护，但其在人体的特殊位置也相对较难以达到。

5.  通过对GH-1 基因剪接的调控治疗II 型IGHD：临床研发了不少小分子复合物，用于增加前mRNA被正确剪接转录的比例，主要是组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi），包括丁酸钠（NaB）、丙戊酸（VPA）、4-丁酸苯酯、SAHA、M34491-96。HDACi可以通过直接调控富含丝氨酸/精氨酸蛋白（SR蛋白）的特定转录因子的表达，来调控基因剪接。目前研究显示这类小分子复合物可以有效的治疗某些基因剪接异常的疾病，例如囊性肺纤维化（CF）和脊髓性肌萎缩（SMA）。GH-1基因中的外显子3剪接受到SR蛋白超家族的两个成员调控：ASF/SF2和SC35，两者的作用互为拮抗。ASF/SF2通过与ESE2结合激活外显子3的剪接，而SC35则作用于ESE2的下游区域，从而阻碍其活性。而HDACi中的一种，丁酸盐，则可以调控剪接因子ASF/SF2，使其过度表达，而过度表达的ASF/SF2则可以促进GH-1基因的正确剪接，增加22 kDa GH的含量。小分子复合物的主要优点是安全。尤其是丁酸盐，临床已经用于治疗镰状细胞贫血和地中海贫血多年，在人体和动物实验中均显示低毒

性和良好的耐受性。丁酸盐的甘油三酯类似物（三丁酸甘油酯）与丁酸盐的结构有95%的相似性，在美国已经被获批作为食物添加剂，且证实在儿童口服后有良好的耐受性。然而，小分子复合物的应用也可能会导致靶外效应，即同一基因或其他基因的其他外显子可能也会受到此类小分子复合物的调控。此外，此类小分子复合物对患者分子水平的长期和短期影响，以及不同剂量、给药途径的治疗效果目前还不得而知。

6.  反义寡核苷酸和反式剪接是未来的研发方向：反义寡核苷酸（AONs）是人工合成的，与靶基因或mRNA某一区段互补的核酸片断，可以通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上，从而封闭基因的表达。AONs是非侵入性的（不会直接改变基因组），并且很稳定。在大鼠和人血浆，以及许多大鼠组织中，AONs的半衰期大约为10-15天。尽管AONs并未用于研发II型IGHD的治疗手段，但研究显示其可以促进脊髓性肌萎缩（SMA）的外显子纳入，因此未来很有可能联合HDACi作为治疗II型IGHD的策略。目前AONs的研发速度相对较缓慢，目前仅有1种AONs获得FDA的批准，其余22种仍处于II期或III期临床研究阶段。当基因剪接发生在同一个前mRNA分子时，称为顺式剪接，反式剪接是指将不同的前mRNA剪接起来，可以用于针对RNA进行的基因治疗。反式剪接对于剪接位点突变位于内含子的第一个或最后一个核苷酸时尤其有效。此类剪接位点的突变通常会造成临床表现最为严重的II型IGHD，此类疾病通常无法通过其他分子治疗策略简单的纠正。然而反式剪接也需要通过表达DNA的载体进入到细胞，因此其缺点与前述的RNA干扰治疗策略一致。

详细内容请点击以下链接阅读：http://f1.aigaogao.cn/cspem/pdf/102369-11.pdf